Flydende biopsier bruger blod-ikke-tumorvæv til at diagnosticere kræft
Typisk undersøges tumorer ved anvendelse af vævsbiopsier. En lille prøve tages fra tumoren og genotypes, eller analyseres for genetisk makeup. Problemet med denne tilgang er, at biopsierende tumorer kan være udfordrende. Desuden giver en tumorbiopsi kun et øjebliksbillede af tumoren.
Skrive i Discovery Medicine i 2015, skriver Labgaa og medforfattere følgende om konventionel tumorbiopsi:
Af indlysende årsager er det svært at overvåge tumorudvikling ved sekventielle biopsier. Også spejlet biopsi kun et enkelt sted af tumoren og er derfor usandsynligt at repræsentere hele spektret af somatiske mutationer i store tumorer. Et alternativ ville være at få flere biopsier til den samme tumor, men denne mulighed virker hverken realistisk eller præcis.
Flydende biopsi involverer måling af cirkulerende DNA (ctDNA) og andre tumor biprodukter i blodprøver opnået fra patienter med cancer. Denne nye diagnostiske tilgang lover at være hurtig, ikke-invasiv og omkostningseffektiv.
Historien om flydende biopsi
I 1948 identificerede et par franske forskere først og fremmest ctDNA i blodet af raske mennesker, Mandel og Métais. Denne opdagelse var forud for sin tid, og det var ikke før årtier senere, at ctDNA blev yderligere udforsket.
I 1977 identificerede Leon og kolleger først øgede mængder ctDNA i blodet af kræftpatienter.
I 1989 identificerede Stroun og kollegerne neoplastiske (dvs. kræft) egenskaber i blodet. Efter disse opdagelser identificerede adskillige andre grupper specifikke mutationer i tumor suppressorer og onkogener, mikrosatellit ustabilitet og DNA-methylering, hvilket viste, at ctDNA frigives i omsætning af tumorer.
Selv om vi ved, at ctDNA afledt af tumorceller cirkulerer i blodet, er oprindelsen, frigivelseshastigheden og frigivelsesmekanismen for dette DNA uklart, med forskning, der giver modstridende resultater. Nogle undersøgelser tyder på, at flere maligne tumorer indeholder mere døde kræftceller og frigiver mere ctDNA. Nogle undersøgelser antyder imidlertid, at alle celler frigiver ctDNA. Ikke desto mindre forekommer det sandsynligt, at kræft tumorer frigiver forøgede niveauer af ctDNA i blodet, hvilket gør ctDNA til en god biomarkør af kræft.
På grund af kraftig fragmentering og lave koncentrationer i blodet er ctDNA svært at isolere og analysere. Der er en uoverensstemmelse mellem ctDNA-koncentrationer mellem serum og plasmaprøver. Det ser ud til, at blods serum i stedet for blodplasma er en bedre kilde til ctDNA. I en undersøgelse af Umetani og kolleger viste ctDNA-koncentrationerne at være konsekvent lav i plasma sammenlignet med serumet på grund af mulig tab af cirkulerende DNA under rensning, da koagulation og andre proteiner elimineres under prøvefremstilling.
Ifølge Heitzer og kolleger er her nogle specifikke problemer, der skal løses for at udnytte det diagnostiske potentiale af ctDNA:
For det første skal præanalytiske procedurer standardiseres .... Udvælgelse af en isoleringsmetode, der sikrer udvindingen af en tilstrækkelig mængde af høj kvalitet DNA er kritisk, og det har vist sig, at præanalytiske faktorer for blodprøveudtagning og -behandling kan stærkt påvirke DNA-udbytte .... For det andet er et af de vigtigste spørgsmål manglen på harmonisering af kvantificeringsmetoder. Forskellige kvantificeringsmetoder, ... producerer forskellige resultater, fordi disse mål måler enten total eller kun amplificerbar DNA .... For det tredje er der mindre kendt om oprindelsen og den detaljerede mekanisme for ctDNA-frigivelse, og i de fleste undersøgelser konfronterer hændelser, som måske også bidrager til frigivelsen af ctDNA.
Målrettede vs. Ikke-målrettede tilgange
I øjeblikket er der to hovedmetoder taget ved analyse af blodplasma (eller serum) for ctDNA. Den første tilgang er målrettet og søger specifikke genetiske ændringer, der tyder på tumorer. Den anden tilgang er ikke-målrettet og indebærer en genomgående analyse, der søger ctDNA, der reflekterer kræft. Alternativt har exome-sekventering været anvendt som en mere omkostningseffektiv, ikke-målrettet tilgang. Udgifter er de dele af DNA, der transkriberes for at lave protein.
Med målrettede tilgange analyseres serum for kendte genetiske mutationer i et lille sæt af drivermutationer.
Drivermutationer refererer til mutationer i genomet, som fremmer eller "driver" væksten af kræftceller. Disse mutationer omfatter KRAS eller EGFR .
På grund af teknologiske fremskridt i de senere år er målrettede tilgange til analysen af genomet for små mængder ctDNA blevet gennemførlige. Disse teknologier indbefatter ARMS (amplifikation ildfast mutationssystem); digital PCR (dPCR); perler, emulsioner, amplifikation og magnetik (BEAMing); og dyb sekventering (CAPP-Seq).
Selv om der er sket fremskridt inden for teknologi, der gør den målrettede tilgang mulig, målrettes den målrettede tilgang kun nogle få positioner af mutationer (hotspots) og mangler mange drivermutationer såsom tumor suppressor gener.
Hovedfordelen ved ikke-målrettede tilgange til flydende biopsi er, at de kan anvendes til alle patienter på grund af, at testen ikke er afhængig af tilbagevendende genetiske ændringer. Tilbagevendende genetiske ændringer dækker ikke alle kræftformer og er ikke specifikke kræft signaturer. Ikke desto mindre mangler denne tilgang analytisk følsomhed, og en omfattende analyse af tumorgener er endnu ikke mulig.
Til gengæld er prisen for sekventering et helt genom blevet væsentligt faldet. I 2006 var prisen på sekventering hele genomet ca. $ 300.000 (USD). I 2017 var omkostningerne faldet til ca. $ 1.000 (USD) pr. Genom, herunder reagenser og afskrivning af sekventeringsmaskiner.
Klinisk anvendelighed af flydende biopsi
Indledende bestræbelser på at anvende ctDNA var diagnostiske og sammenlignede niveauer hos raske patienter med patienter med kræftpatienter eller patienter med godartet sygdom. Resultaterne af disse bestræbelser blev blandet med kun nogle undersøgelser, der viste signifikante forskelle, der indikerer cancer, sygdomsfri status eller tilbagefald.
Årsagen til, at ctDNA kun kan bruges en del af tiden til at diagnosticere cancer, er fordi variable mængder ctDNA er afledt af tumorer. Ikke alle tumorer "shed" DNA i samme mængde. I almindelighed kaster mere avancerede, udbredte tumorer mere DNA i kredsløbet end tidligt lokaliserede tumorer. Derudover udskyder forskellige tumortyper forskellige mængder DNA i cirkulationen. Den fraktion af cirkulerende DNA, som er afledt af en tumor, er meget variabel i forhold til undersøgelser og kræftformer, der varierer fra 0,01% til 93%. Det er vigtigt at bemærke, at i almindelighed kun en minoritet af ctDNA stammer fra tumoren, resten kommer fra normale væv.
Cirkulerende DNA kunne anvendes som en prognostisk markør for sygdom. Cirkulerende DNA kunne bruges til at overvåge ændringer i kræft over tid. For eksempel viste en undersøgelse, at den toårige overlevelsesrate hos patienter med kolorektal cancer (dvs. antallet af patienter, der stadig lever mindst to år efter diagnosen med kolorektal cancer) og KRAS- hotspotmutationerne var 100 procent hos dem uden bevis for tilsvarende cirkulerende DNA. Desuden er det muligt, at cirkulerende DNA i den nærmeste fremtid kan bruges til at overvåge precancerøse læsioner.
Cirkulerende DNA kunne også bruges til at overvåge respons på terapi. Fordi cirkulerende DNA profferer et bedre overordnet billede af den genetiske sminke af tumorer indeholder dette DNA sandsynligvis diagnostisk DNA, som kan anvendes i stedet for diagnostisk DNA opnået fra tumorer selv.
Lad os nu tage et kig på nogle specifikke eksempler på flydende biopsi.
Guardant360
Guardant Health udviklede en test, der anvender næste generations sekventering til profilering af cirkulerende DNA til mutationer og kromosomale omlejringer for 73 kræftrelaterede gener. Guardant Health offentliggjorde en undersøgelse om brugen af flydende biopsi i onkologi. Undersøgelsen brugte blodprøver fra 15.000 patienter med kombineret 50 tumortyper.
For det meste er resultaterne fra den flydende biopsitest justeret med genændringer observeret i tumorbiopsier.
Ifølge NIH:
Guardant360 identificerede de samme kritiske mutationer i vigtige kræftrelaterede gener som EGFR, BRAF, KRAS og PIK3CA ved frekvenser, der ligner meget, hvad der tidligere var blevet identificeret i tumorbiopsiprøver, der statistisk korrelerede til 94% til 99%.
Desuden rapporterede forskerne i henhold til NIH følgende:
I en anden komponent af undersøgelsen vurderede forskerne næsten 400 patienter, hvoraf de fleste havde lunge- eller kolorektal cancer - der havde både blodctDNA- og tumorvævs-DNA-resultater tilgængelige og sammenlignede mønstrene for genomiske ændringer. Den overordnede nøjagtighed af den flydende biopsi i sammenligning med resultaterne fra tumorbiopsianalyserne var 87%. Nøjagtigheden steg til 98%, da blod og tumorprøver blev samlet inden for 6 måneder af hinanden.
Guardant360 var korrekt, selv om niveauerne af cirkulerende DNA i blodet var lave. Ofte udgør cirkulerende tumor-DNA kun 0,4 procent af DNA'et i blodet.
Samlet set kunne Guardant-forskerne identificere tumormarkører, der kunne behandle læger hos 67 procent af patienterne ved hjælp af flydende biopsi. Disse patienter var berettiget til FDA-godkendte behandlinger samt undersøgelsesbehandlinger.
ctDNA og lungekræft
I 2016 godkendte FDA cobas EGFR Mutation Test, der skal anvendes til påvisning af EGFR mutationer i det cirkulerende DNA hos patienter med lungekræft. Denne test var den første FDA-godkendte flydende biopsi og identificerede patienter, der kan være kandidater til behandling med målrettede terapier, der bruger erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) og gefitinib (Iressa) som førstebehandling og osimeritinib (Tagrisso) som anden linje behandling. Disse målrettede terapier angriber kræftceller med specifikke EGFR- mutationer.
På grund af det høje antal falsk-negative resultater anbefaler FDA, at en vævsbiopsiprøve også tages fra en patient, der har en negativ væskebiopsi.
ctDNA og levercancer
Antallet af mennesker, der dør af levercancer, er steget i løbet af de sidste 20 år. I øjeblikket er levercancer den næstledende årsag til kræftdød i verden. Der er ingen gode biomarkører til rådighed til at detektere og analysere lever- eller hepatocellulær (HCC), kræft. Cirkulerende DNA kan være en god biomarkør for levercancer.
Overvej følgende citat fra Lagbaa og medforfattere om muligheden for at bruge cirkulerende DNA til at diagnosticere levercancer:
Hypermethylering af RASSF1A, p15 og p16 er blevet foreslået som tidlige diagnostiske værktøjer i en retrospektiv undersøgelse, herunder 50 HCC patienter. En underskrift af fire aberrantly-methylerede gener (APC, GSTP1, RASSF1A og SFRP1) blev også testet for diagnostisk nøjagtighed, mens methylering af RASSF1A blev rapporteret som en prognostisk biomarkør. Efterfølgende undersøgelser analyserede ctDNA hos HCC-patienter ved anvendelse af dyb sekventeringsteknologier .... Påfaldende blev afvigende DNA-kopiantal detekteret i to HBV-bærere uden tidligere HCC-historie på tidspunktet for blodindsamling, men som udviklede HCC under opfølgning. Dette fund har åbnet døren for at evaluere kopiantalvariation i ctDNA som et screeningsværktøj til tidlig HCC-detektion.
Et ord fra
Flydende biopsier er en spændende ny tilgang til genomisk diagnose. I øjeblikket er visse væskebiopsier, som tilbyder omfattende molekylær profilering, tilgængelige for læger for at komplementere genetiske informationer opnået fra vævsbiopsi. Der er også visse flydende biopsier, der kan bruges i stedet for vævsbiopsi - når vævsbiopsier ikke er tilgængelige.
Det er vigtigt at huske på, at der i øjeblikket er mange flydende biopsiforsøg, og der skal gøres mere forskning for at udrydde terapeutisk nytte af denne intervention.
> Kilder:
> Blodtest for genetiske ændringer i tumorer viser løfte som alternativ til tumorbiopsi. NIH.
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Cirkulerende tumor-DNA som en væskebiopsi for kræft. Klinisk kemi. 2015; 61: 112-123. doi: 10.1373 / clinchem.2014.222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Flydende biopsi i levercancer. Discovery Medicine. 2015; 19 (105): 263-73.
> Flydende biopsi: Brug af DNA i blod til at detektere, spore og behandle kræft. NIH.
> Umetani N, et al. Højere mængder af frit cirkulerende DNA i serum end i plasma skyldes ikke hovedsageligt kontamineret fremmed DNA under separation. Ann NY Acad Sci. 2006; 1075: 299-307.
> Wellstein A. Generelle principper i cancerbehandling af cancer. I: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. red. Goodman & Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 13th New York, NY: McGraw-Hill.